香港佛教殯儀

摘　要　目的:探討大蒜素誘導卵巢癌細胞株OVCA-3凋亡規律。方法:應用DNA斷裂點標記（TUNEL）法、DNA凝膠電泳以及光鏡等技術觀察有關細胞的凋亡情況。結果:0.01∼100μg/ml的大蒜素作用OVCA-3細胞2h及10μg/ml的大蒜素作用OVCA-3細胞不同時間，錐蟲藍染色陽性率均在18.5%以下。TUNEL顯示：1∼100μg/ml的大蒜素作用OVCA-3細胞2h，即出現典型的細胞凋亡特征；50μg/ml時凋亡率為65.9%。結論:一定劑量范圍內的大蒜素可在直接殺傷作用較小的情況下明顯誘導OVCA-3細胞凋亡，不會因細胞壞死而引起炎症反應，這對於大蒜素應用於臨床將有重要意義。

1　材料和方法

　　1.1　細胞培養　OVCA-3細胞由上海醫科大學婦產科醫院提供，用含10%小牛血清的RPMI1640（Gibco公司）完全培養液37℃CO2孵箱內培養，潮濕空氣中含有5%CO2。

　　1.2　試劑　大蒜素（二烯丙基硫代磺酸酯）為上海禾豐制藥有限公司生產，30mg(2ml),批號：950901。TUNEL標記液、Streptavidin-AP、鹼性磷酸酶底物（NBT/BCIP）等主要試劑均購自德國寶靈曼公司。

　　1.3　大蒜素對OVCA-3細胞劑量毒性實驗　調整OVCA-3細胞密度為2.5×105個/ml，1ml細胞懸液接種在進口24孔板中,在5%CO2培養箱中培養，24h後加不同濃度大蒜素。對照組為空白對照。繼續培養2h後錐蟲藍染色,計算細胞死亡率。

　　1.4　大蒜素對OVCA-3細胞時間毒性實驗　調整OVCA-3細胞密度為2.5×105個/ml，接種細胞懸液1ml於進口24孔培養板中，繼續培養，24h後加終質量濃度為10μg/ml的大蒜素於各孔中，分別於30，60，90，120，150，180min用0.4%錐蟲藍染色，計數死細胞。

　　1.5　TUNEL法　調整OVCA-3細胞密度為2.5×105個/ml，在進口6孔培養板中放入無菌蓋玻片，接種細胞懸液2ml於6孔培養板中的蓋玻片上，繼續培養，24h後加入不同濃度大蒜素。另設0.2μg/ml羥基喜樹鹼對照組及空白對照組。加藥2h後在6孔培養板中加入40%甲醛50μl於各孔，固定5min,2500r/min離心15min，取出蓋玻片，PBS洗滌2次，加穿透液（含0.1%TritonX-100，0.1%NaAc）200μl,PBS洗滌，晾干。於37℃水浴用TUNEL標記液作用60min。加Streptavidin-AP置37℃水浴30min。鹼性磷酸酶底物（NBT/BCIP）顯微鏡下顯色。核固紅復染細胞核。自然干燥後中性樹膠封片。顯微鏡下計數100個細胞(共3個視野)，細胞核染成藍色為陽性細胞，計算陽性率。

　　1.6　核酸電泳　調整細胞密度為2.5×105個/ml，接種細胞懸液2ml於6孔板中,培養24h後,加入終質量濃度分別為0.1，1，10，50，100，200μg/ml的大蒜素，並設空白對照。2h後收集細胞懸液。每孔加DNA抽提液（含TBE，RNase，NP-40等）20μl，50℃水浴，60min。加蛋白酶K3μl（10mg/ml），50℃水浴，2h。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳,50V2h,EB染色,紫外燈下觀察DNA電泳結果。

　　2　結　果

　　2.1　大蒜素對OVCA-3細胞劑量毒性實驗結果　結果顯示，0.01∼100μg/ml的大蒜素作用OVCA-3細胞2h時,錐蟲藍染色陽性率均在18.5%以下。0.01∼1μg/ml陽性率與空白對照接近，10μg/ml時升至最高，至50∼100μg/ml時又呈下降趨勢。

　　2.2　大蒜素對OVCA-3細胞時間毒性實驗結果　用10μg/ml大蒜素作用不同時間，細胞錐蟲藍染色陽性率均在18.5%以下。空白對照組培養不同時間的細胞染色陽性率均在10.9%以下。