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絕症用的中醫及西醫處方 : 中醫及西醫腫瘤科 : 膀胱癌中醫及西醫驗方 : 大蒜素對小鼠膀胱癌的體內及體外抗腫瘤效果的實驗研究


	大蒜素對小鼠膀胱癌的體內及體外抗腫瘤效果的實驗研究【摘要】目的了解大蒜素對小鼠膀胱腫瘤的抗腫瘤效果與機制。方法通過MTT實驗評定了大蒜素的直接細胞毒活性，動物實驗顯示大蒜素在體內有明顯的抗腫瘤效果，並用LDH釋放法測細胞毒活性。結果大蒜素對膀胱腫瘤有直接細胞毒作用。大劑量治療組與對照組相比，腫瘤的生長速度明顯受到抑制（P＜0.01），大蒜素治療後產生了針對B16腫瘤細胞的淋巴細胞。結論大蒜素對膀胱腫瘤有明顯的抗腫瘤作用。這種效果可能與直接細胞毒作用和免疫反應有關。大蒜素可能是一種有效的表淺膀胱癌腔內治療藥物。大蒜為百合科蔥屬兩年生草本植物，有效成分為大蒜素，在我國民間藥用已有三千多年的歷史。現代研究提示大蒜對腫瘤有良好的防癌、抗癌作用。有報道顯示大蒜提取液對膀胱腫瘤生長有明顯抑制作用，但是一些實驗動物死於治療相關的毒性〔1〕。　　B16腫瘤細胞是美國田納西大學（Tennessee University）M.S.Soloway利用口服N-甲酰胺（FANFT）從C3H小鼠誘發而來〔2〕。這種低分化移行細胞癌所表現的轉移特性與人移行細胞癌相類似。為了解大蒜素對膀胱腫瘤的治療效果和機理，我們測定了大蒜素在體外對B16腫瘤細胞生長的影響，並且評估了其在體內抗腫瘤效果和對局部免疫的影響。　　1 材料與方法　　1.1 動物30只6～8周齡雌性C3H/He鼠（體重g）是從北京維通利華實驗技術有限公司購得。所有實驗均根據廣東醫學院動物實驗指南進行。　　1.2 腫瘤細胞和大蒜素B16腫瘤細胞由日本癌症資源庫（JCRB）的細胞庫提供（細胞編號：IFO50041）。培養於含10%小牛血清（FBS）的DMEM（GIBCO BRL，Life Technologies,MD,USA）和37℃的5%CO2中。大蒜素是由廣東萬基藥業有限公司生產（批准文號：國藥准字H44023561，生產批號20030509，規格25 mg/支；分子式C6H10S3；分子量178.33）。　　2 方法　　2.1 MTT實驗在96孔板中建立細胞培養。在每孔中含5×103B16腫瘤細胞，每5孔為一組。為測定大蒜素在體外對腫瘤細胞生長率的影響，將不同劑量的大蒜素（2.5 ，0.5，0.1，0.02 mg‧ml-1）與B16細胞共同培養48 h。加入MTT試劑培養最後4 h。酶標儀上波長560 nm測定OD值。　　2.2 動物實驗為測定大蒜素對膀胱腫瘤的治療效果，將C3H/He小鼠分成3組，每一組含10只小鼠。第1組注射生理鹽水1 ml（對照組），第2組注射12.5 mg大蒜素（低劑量組），第3組則注射25 mg大蒜素（高劑量組）。所種植的腫瘤細胞均用細胞鏟從培養瓶中收集，用生理鹽水洗2次。並將其懸浮於生理鹽水中。濃度調整為1×106細胞/ml。將腫瘤細胞種植到C3H小鼠在後側腹皮下，劑量為0.1 ml。次日將大蒜素注射到腫瘤附近的皮下，劑量分別為12.5 mg和25 mg的大蒜素。每周兩次用測量器測定腫瘤的兩徑，觀察腫瘤的生長情況〔3〕。　　2.3 LDH釋放法測細胞毒活性C3H/He小鼠皮下注射25 mg大蒜素一次進行免疫，注射生理鹽水作為陰性對照。1周後收集脾細胞。96孔培養液板中將效應脾細胞與B16靶細胞按不同比例混合（混合比例從12.5︰1到100︰1）。每組3孔。在實驗前，B16靶細胞與絲裂霉素C注射液（100 μg/ml）共同培養1 h。96孔培養板在37℃ CO2培養箱中培養24 h。按LDH細胞毒試劑盒提供方法與492 nm波長下檢測。見圖1。　　細胞毒活性（%）=100%×實驗組LDH-自然釋放LDH最大釋放LDH-自然釋放LDH 　　2.4 統計學分析將所有結果進行統計分析，分析軟件為SPSS11，分析方法為通過方差分析以後的兩兩比較計算P值。　　3 結果　　3.1 大蒜素對腫瘤細胞的體外影響MTT實驗表明，當大蒜素劑量為0.1 mg/ml時，即有中度細胞毒作用，腫瘤的抑制率可達到55.7%，劑量為2.5 mg/ml對膀胱癌細胞有顯著的直接細胞毒作用（腫瘤抑制率達到98.6%）。結果見表1。　　圖1 LDH釋放法測細胞毒活性（略）　　表1 大蒜素對B16腫瘤細胞體外生長的抑制（略）　　3.2 大蒜素的在體抗腫瘤效果與對照組相比，大蒜素大劑量治療組明顯延遲了腫瘤的發生。在注射19 d後，對照組的腫瘤發生率即高達80%；而小劑量治療組（12.5 mg）的腫瘤發生率為50%；但是大劑量治療組（25 mg）的腫瘤發生率卻僅為20%（圖2）。在第19天，生理鹽水對照組，小劑量治療組和大劑量治療組的腫瘤面積分別是（0.86±1.20），（0.73±1.06）和（0.22±0.54）。大劑量治療組與生理鹽水對照組相比，腫瘤的生長速度明顯受到抑制（P＜0.01）。結果見表2。　　3.3 大蒜素治療後，產生了針對B16腫瘤細胞的細胞毒T淋巴細胞　　為研究這種治療方法是否能促進體內淋巴細胞腫瘤細胞的細胞毒活性，將C3H小鼠注射25 mg大蒜素進行免疫，注射生理鹽水作陰性對照。如圖2所示，大蒜素免疫後產生了針對B16腫瘤細胞的細胞毒淋巴細胞〔4〕，而生理鹽水則無此作用。　　4 討論　　大蒜素（Allium sativum）化學名為二烯丙烯丙基三硫，是大蒜的主要成分。1997年D.R.Riggs等發現老蒜提取液濃度為31.3 mg/ml時，對B16腫瘤細胞的抑制率是29.9%；當濃度為62.5 mg/ml或高於此時，老蒜提取液對膀胱癌細胞有明顯直接的細胞毒活性（抑制率98%）〔5〕。　　表2 大蒜素治療後腫瘤的面積（略）　　大劑量大蒜素與對照組比較，*P＜0.01 　　圖2 大蒜素治療後腫瘤發生率（略）　　我們在研究中觀察到大蒜素對腫瘤細胞有直接的細胞毒活性。MTT實驗表明，大蒜素的濃度為20 μg/ml時即有中度直接細胞毒作用，抑制率可達到41%；當濃度為2.5 mg/ml時可見到重大的直接細胞毒活性（腫瘤抑制98.6%）。與老蒜提取液相比，大蒜素的生物學活性要強25倍。這可能是因為兩者的主要成分不同，雖然它們都來源於大蒜，但是老蒜提取液的主要成分是S-烯丙基半胱氨酸。　　大蒜素對腫瘤細胞直接抑制的機理目前還不清楚。大蒜素的細胞毒作用可能是通過降低活性氧類自由基水平，影響腫瘤細胞NFκB活性，使NFκB與DNA結合的活性降低，NFκB通路受到抑制，導致某些基因表達水平改變〔6〕；或通過降低芳香胺拟N拟乙酰基轉移酶以及2拟aminofluorene 活性，從而抑制腫瘤細胞的生長〔7〕。此外，大蒜素抗腫瘤的另一個重要機制是刺激免疫系統。　　動物實驗顯示大蒜素在體內有明顯的抗腫瘤效果。這種效果與劑量有關。在大劑量治療組，無論是腫瘤發生率還是腫瘤生長速度均明顯低於小劑量治療組。　　LDH釋放法測細胞毒活性實驗的結果也表明，注射大蒜素後，能產生針對B16腫瘤細胞的細胞毒T淋巴細胞。大蒜素刺激免疫的機制與大蒜相類似。一些研究表明大蒜能引起IL拟2，TNF拟α以及IFN拟γ的釋放，並增強噬菌作用〔8〕。大蒜的其他活性包括增進殺傷細胞活性以及淋巴細胞對絲裂原刺激的免疫增殖反應〔9〕。這些效應，特別是細胞因子釋放模式，表明大蒜素激活Th1細胞免疫反應，這種反應是有效抗腫瘤免疫治療所特有。　　綜上所述，大蒜素對膀胱瘤有明顯的抗腫瘤效果。這種效果可能與其直接細胞毒作用和免疫反應有關。本研究說明了大蒜素對膀胱腫瘤的生物學活性，並支持這樣一個觀點，即大蒜素是一種有效的化學預防或化學治療藥物。大蒜素可能是一種有效的表淺膀胱癌腔內治療藥物，而且價格低廉，不良反應小，值得臨床推廣使用。【參考文獻】　　〔1〕 Lamm DL ,Riggs DR.The potential application of Allium sativum (garlic) for the treatment of bladder cancer〔J〕.Urol Clin North Am 2000,27(2)：157. 　　〔2〕 MickeyDD,Mickey GH,Murphy WM et al.In virto characterzation of four N-〔4拟(5拟nitro 拟2拟furyl)拟2拟thiazoly〕formamide(FANFT) induced mouse bladder tumors.〔J〕.Urol,1982,Jun,127(6)：1233. 　　〔3〕上海市腫瘤研究所流行病學研究室.1998年上海市市區惡性腫瘤發病率〔J〕.腫瘤，2001，21（4）：312. 　　〔4〕王堅，譚明天，吳宏，等.泌尿外科惡性腫瘤住院患者的情況調查〔J〕.廣東醫學，2001，22（10）：964. 　　〔5〕 Riggs DR,DeHaven JI and Lamm DL.Allium sativum(garlic) treatment for murine transitional cell carcinoma〔J〕.Cancer 1997,79(10)：1987. 　　〔6〕 Dirsch VM,Gerbes AL and Vollmar AM.Ajoene,a compound of garlic ,indeces apoptosis in human promyeloleukemic cells,accompaied by generation ofreactive oxygen species and activation of nuclear factor happaB.〔J〕.Mol Pharmacol .1998,53(3)：402. 　　〔7〕 Lin JG,Chen GW,Su CC,et al.Effects of garlic components dially sulfide and diallyl disulfide on arylamine N-acetyltransferase activity and 2-aminofluorene-DNA adducts in human promyelocytic leukemia cells.Am〔J〕.Chin Med .2002,30(2～3)：315. 　　〔8〕 Dausch JG,Nixon DW.Garlic:A review of its relationship to malignant disease〔J〕.Prev Med 1990,19(3)：346 . 　　〔9〕 Kyo E.Suzuki A.Kakimoto M,etal.Immunomodulation and antitumor activities of age garlic extract〔J〕.Phyto medicine 1998,5(4)：259.

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